作者：敬華
校稿：劉宇宸、陳奕叡、莊焙祺
在經歷漫長的演化後，許多生物發展出利用光的能力。無論是利用陽光固碳製造有機養分的植物、藻類，或是透過視覺覓食、避敵、感測周圍環境的動物，都是受益於光的生物。除了光合作用與視覺，光的存在對於生物還有甚麼「看不見」的重要性嗎?光對於生物體而言是完全有益無害的嗎？生物又透過甚麼方式感測光的存在，並且趨吉避凶呢？
光裂解酶：細胞的太陽眼鏡
陽光是有可能對生物造成傷害的。太陽光中的紫外光波長短、能量高，可能導致生物體中的有機物質產生有害的化學變化，也能誘發存在於所有生物中鹼基變質，造成遺傳密碼 DNA 的突變，不利於生物的自我複製。DNA 中的嘧啶（pyrimidine）在紫外光的照射下會形成兩種嘧啶雙體：環丁烷嘧啶雙體（cyclobutane pyrimidine dimer, CPD）以及嘧啶-嘧啶酮 6-4 光產物（pyrimidine-pyrimidone 6-4 photoproduct, 6-4PP）（圖一）。當 DNA 中的兩個相鄰嘧啶變成了這兩種化合物，在 DNA 複製時 DNA 聚合酶便無法將之與正確的嘌呤配對，錯誤的 DNA 序列就此產生並從此保存在子細胞中。
光裂解酶（photolyase）是一種能夠把 CPD 或者 6-4PP 打回原形的酵素。古菌、真細菌、真核生物都具有這類的酵素。光裂解酶具有與 DNA 結合的能力，屬於一種帶有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenosine dinucleotide, FAD）的黃素蛋白（flavoprotein）。因為帶著能夠吸收藍光的 FAD作為輔酶（coenzyme），使得光裂解酶在內的黃素蛋白帶有不同於尋常蛋白質的鮮豔黃色（圖一）。在細胞中，FAD 與其還原態 FADH2 是氧化還原反應的輔酶，此時 FAD 還原成 FADH2 所需的兩個電子來自受質的氧化；而光裂解酶的還原相當特殊，除了還原劑外還需要光照。
隱花色素：演化自光裂解酶的細胞日晷
隨著臭氧層的出現，地表紫外線減弱，再加上其他 DNA 修復機制的出現，有些現生的生物已失去利用光能修復 DNA 損傷的能力，例如單孔類（鴨嘴獸、針鼴）以外的哺乳動物就沒有光裂解酶。不過這些生物基因組中的光裂解酶並非完全消失，而是以隱花色素（cryptochrome）的樣子繼續存在於基因組中。隱花色素在蛋白質的序列與結構上都像是長了尾巴的光裂解酶，具有較後者長的 C 端序列，而 N 端序列與結構在這兩個不同功能的蛋白質間則具有極高的相似度。
科學家認為，隱花色素演化自光裂解酶，在過程中隱花色素完整的保留了光裂解酶的藍光還原機制，因此 FAD、電子傳遞徑、乃至於天線色素的結合位幾乎不變，但是隱花色素失去了修復 DNA 的能力，同時變長的 C 端序列使得隱花色素能與不一樣的蛋白質互動。雖然失去了修復 DNA 的酵素活性，但隱花色素保有的光還原能力，加上多出來的 C 端序列跟著 FAD 的還原狀態變形，使其意外地變成感測光強度並依此調整細胞基因表現的不二人選。科學家們觀察到一些隱花色素的 C 端尾被去掉後，便具有光裂解酶的活性，以及分離自單細胞綠藻的隱花色素，同時具有光週期調控與 DNA 修復能力兩種功能，這兩者都是這個演化假說成立的有力證據。
以發現於果蠅體內，演化自 6-4PP 光裂解酶的動物型隱花色素（animal cryptochrome, aCRY）為例－－隱花色素（此處稱 DmCRY）似乎與果蠅的近日節律（circadian rhythm）控制有關。DmCRY 照光活化後與TIM結合，形成的 DmCRY-TIM 複合體會被降解，導致 TIM 的濃度下降，使TIM負調控的日間基因 CLK/CYC 轉錄因子持續維持活性。簡而言之，DmCRY 幫助果蠅原本的生理時鐘跟環境的日照變化進行對錶，使控制近日節律的基因活性變化與日照時間同步。
如前所述，DmCRY 結構與光裂解酶極為相似，具有 FAD 與由四個色胺酸組成的電子傳遞徑，說明 DmCRY 有可能像光裂解酶一樣，具有藍光的光還原活性。而比較照光前與照光後的 DmCRY 結構，除了 FAD 獲得一個電子變成了 FAD• 外，可以發現 C 端尾的位置有相當大的差異，說明了 DmCRY 結構變化受光驅動，C 端尾的位置變化可能跟 FAD 的還原反應是連動的； C 端尾原本佔據的位置在 DmCRY-TIM 複合體中，剛好被 TIM 的一段α-螺旋取代，這也是為甚麼只有在照光後 DmCRY 才能與 TIM 結合。無論是照光後基因表現的變化或者 DmCRY 與DmCRY- TIM 的結構比較，都體現了隱花色素利用與光裂解酶相同的光還原反應，作為光受體的精妙運作模式與重要性。
隱花色素的一體兩面：不照光也影響深遠
文章看到現在，隱花色素似乎像當用則用的光裂解酶，只有照光後才具有功能？非也非也！在漫長的演化後，隱花色素也學會了新把戲。植物型隱花色素（plant cryptochrome, pCRY）調控了植物的光型態發生與近日節律，已知 pCRY 照光後也會發生結構改變，還會發生在 aCRY 沒有的自磷酸化（autophosphorylation），並且與其他活化的 pCRY 分子型成複合體。以阿拉伯芥的隱花色素 AtCRY2 為例，照光後磷酸化的 AtCRY2 會形成四聚體，並與各種轉錄因子互動，使植物開始表現在光照下生長所需的基因。而近期研究發現 AtCRY2 在不照光時，處於 FAD 完全氧化態的 AtCRY2 也能與促進暗型態發生的轉錄因子 FL1/FL3 結合，增加黑暗中生長所需基因的表現量。科學家推測因為 AtCRY2 在照光後，用來與 FL1/FL3 結合的表面位於 AtCRY2 形成四聚體圓圈的內側，因此只有在黑暗中單體 AtCRY2 才有與 FL1/FL3 結合的活性。這個發現扭轉了隱花色素必須照光才有功能的假設，並且提供了隱花色素平時都在幹嘛的可能線索。
定格光裂解酶與隱花色素
結構生物學至今仍無法記錄生物大分子在生化反應時的結構變化，只能將分子定格，觀察特定狀態下的生物大分子互動。然而對光裂解酶與隱花色素而言，因為得天獨厚的光驅動反應，使得科學家們可以透過時間解析序列晶體繞射（time-resolved serial crystallography），觀察反應不同階段的結構變化。這個技術透過雷射觸發晶體中的化學反應，並且在一段選定的時間後用高解析度的X光繞射記錄晶體中的蛋白質結構。雖然一次只能記錄一個時間點的晶體結構，但透過精準地記錄反應開始後（也就是照光後）不同時間點的資料，最後可以將不同時間點依序串連，像用膠捲拍電影一樣得到連續的結構變化。
以古菌 Methanosarcina mazei 的 CPD 光裂解酶 MmCPDII 的研究為例，來自中央研究院生物化學研究所、台灣大學化學系的研究團隊，與多個國際研究團隊合作，透過高空間解析度的X光晶體學（X-ray crystallography）為基礎衍生的時間解析序列飛秒晶體學（time-resolved serial femtosecond crystallography, TR-SFX），記錄還原態的光裂解酶修復CPD損傷及釋放復原鹼基的詳細過程。在這篇研究中，因為 TR-SFX 的高時間解析度，讓研究團隊得以辨識以往認為發生在一毫秒內一氣呵成的CPD修復，其實能分成數個階段。首先，照光後的數百皮秒（picosecond, 10-12秒）內，FAD 將一個電子傳給 CPD，造成兩個 T-T 雙體之間的鍵結斷裂；3奈秒後，CPD 變回正常的鹼基，將電子還給 FAD。雖然修復 CPD 損傷的過程在數個奈秒完成，但是研究團隊發現，接下來 MmCPDII-DNA 複合體的一連串結構變化花了將近一毫秒，也就是將近一百萬倍的時間，才將修復完成的 DNA 鹼基放出 MmCPDII 的催化點位。而他們觀察到的 MmCPDII 結構變化，對於光裂解酶如何恢復自身的活性、如何透過結構變化加快受質的釋放等，不只是光裂解酶結構研究的重要突破，更是對於酵素與受質互動時的結構變化如何促成酵素反應發生的重要參考資料。
而原班人馬也用一樣的技術，以模式綠藻 Chlamydomonas reinhardtii 的動物型隱花色素 CraCRY 為模型，說明照光後 FAD 的還原如何驅動隱花色素的結構變化。研究團隊發現，照光後位於 CraCRY 內部的 FAD 在被還原成 FADH 時，電子的傳遞也造成了 C 端尾-光裂解酶同源域之間的側基交互作用減弱；因此 C 端尾在照光後數毫秒到數百毫秒間逐漸離開原位，同時 FAD 獲得氫離子變成較穩定的電中性 FADH，也使 CraCRY 被藍光穩定地活化。這篇研究除了解答隱花色素如何受光激發而活化，更進一步透過 CraCRY 作為模型，詳述對 aCRY 功能而言相當重要的 C 端尾構型改變如何發生。
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