作者：敬華
自 2004 年泛素 - 蛋白酶體系統 ( ubiquitin-proteosome system, UPS ) 的發現榮獲諾貝爾化學獎後，還有更多的研究指出了 UPS 在細胞涉及了各種的生理反應，幾乎無孔不入地在傳訊途徑中出現。在科學家們研究 UPS 在生物系統中還有什麼未知的角色時，有另一群的科學家突發奇想，決定試著綁架這套蛋白質的暗殺系統，作為疾病的解藥，那麼現在這個偉大的綁架計畫進行到哪了呢？
UPS 與負責貼標籤的 E3 ligase
細胞中最重要的功能分子——蛋白質的控制是個頻繁的過程，蛋白質的生命週期，大多都能以發揮功能，然後被降解或被抑制這個過程來描述，泛素 - 蛋白酶體系統 ( ubiquitin-proteosome system, UPS ) 則是在細胞中以高精準度進行這個循環的系統。UPS 中的泛素本身並不能自發地貼在其他蛋白質上，首先要先使用 E1 泛素活化酶將泛素腺苷化，然後 E2 泛素轉移酶會接手活化的泛素，用一個半胱胺酸側基形成的硫酯鍵帶著泛素去找 E3 連接酶 ( E3 ligase ) ，由 E3 ligase 催化受質的泛素化，而在最常見的狀況中， E3 ligase 會一口氣接四個泛素標籤到目標蛋白上，一旦結構為筒狀 26S 蛋白酶體 ( 26S proteasome ) 遇到了有四個泛素修飾的蛋白質，就會開始將蛋白質變性並降解 ( 如圖一 ) 。
在泛素運送的過程中， E3 ligase 與哪個蛋白質作用將決定最後泛素化的目標，可以說 E3 ligase 是 UPS 中連接辨識以及降解間的樞紐。
E3 ligase 通常是多個蛋白質組成的複合體，其中有一大坨的蛋白質是 E3 ligase 家族共有的：這些蛋白大多負責與 E2 轉移酶結合、催化泛素連接到受質上等等；另外，有一群專門辨識標的蛋白、控制複合體要泛素化哪個受質的蛋白質，堪稱 ligase 複合體的首腦，如 SCFTIR1 裡的 TIR1 及 SCFCOI1 裡的 COI1 等 F-box protein 家族的蛋白，便擔當此重任。而這兩個 E3 ligase 複合體也都包含 ASK1 、 CUL1 、 RBX1 這三個「一大坨蛋白質」中的成員。 ( 如圖二 )
E3 ligase 可以藉由分子膠水與受質相連
至於什麼樣的蛋白質會被 E3 ligase 揪出來泛素化呢？科學家經過長久的觀察，提出了兩個最基本的條件：能夠泛素化的點位 ( 大多為離胺酸 Lysine 的側基 ) 、能被 E3 ligase 辨識的分子特徵，這兩個缺一不可的條件合稱降解決定子 ( Degron ) 。聽起來似乎我們在某個目標蛋白上找到降解決定子，就可以坐等 E3 ligase 去修理它，但當然沒有那麼容易。
事實上，E3 ligase在生物體中不只一種，每一種對受質的辨認也有所差異。不過它們辨認受質的方法可以大致整理為：
1.透過辨識特定的胺基酸序列
2.透過辨認共價轉譯後修飾的官能基 ( Post-translational modification, PTM )
3.透過標的蛋白非共價地與其他分子結合後才可被辨識。
其中第一種及第二種都需要蛋白質上有特殊的序列，舉例而言，與缺氧逆境偵測相關的 pVHL 得靠在特定序列中的羥脯胺酸 ( hydroxyproline ) 辨認並泛素化 HIF1-α ，然而並不是所有的蛋白質都有這種帶有特殊脯胺酸修飾的序列 ( 欲知詳情請見下方的框框 ) ，這種蛋白質一級結構特性不是能透過環境中的分子輕易改變的。因此在這裡我們會特別討論第三種。讓我們看看一個有名的實例：生長素的訊號傳遞路徑中 AUX/IAA 轉錄因子的降解：
沙利竇邁：慘痛代價下的意外發現
事實上在 UPS 系統為人所知以前，人們已不小心地做出了分子膠水。惡名昭彰的沙利竇邁 ( Thalidomide ) 是約 1950 一年代上市的一種抑制孕婦孕吐的藥物，但卻因為嚴重的致畸變副作用而停產回收，這是人類第一次發現藥物的旋光性能決定它是藥抑或是毒。然而沙利竇邁的特殊藥理作用引起人們極大的興趣，在 60 年後的 2010 年，科學家終於發現沙利竇邁是作用於一種名為 CRL4CRBN 的 E3 ligase 複合體中的 Cereblon ( CRBN ) 蛋白上，做為分子膠水改變了 Cereblon 蛋白的受質辨識對象，使得 Cereblon 會辨認對於正常四肢發育相當重要的 SALL4 轉錄因子，而造成胎兒發育異常 ( 圖四 ) 。奇怪的是，之後針對結構類似沙利竇邁的化療藥物的研究發現，這些藥物一樣與 Cereblon 結合，但是能夠標記的標的蛋白卻與沙利竇邁不盡相同。這個發現也驗證了我們在前段所提到，分子膠水的結構改變連帶造成的結合位變化，將使 E3 ligase 將矛頭轉向完全不同的蛋白質。
這個加這個，做出 PROTAC 站著把標的蛋白降解了
舉例而言，在圖五右上的 MZ1 PROTAC 連接沙利竇邁與能塞進轉錄因子 BRD4 的抑制基團， MZ1 就能把名為 CRL2VHL E3 ligase 召募來泛素化 BRD4 。這個 PROTAC 專一性較低， BRD4 的同源蛋白質 BRD2、3 也可以被 MZ1 辨識。如果把 MZ1 連接鏈變成一個環狀的結構接連起來，這個新的 PROTAC 雖然變得更僵硬一點，但是對 BRD4 的專一性就大大地上升了，結晶學研究發現專一性提高乃是肇因於增強的蛋白質交互作用，還有分子結構僵化造成的對 BRD2、3 的親和力下降。在這個例子中我們看到，想要對 PROTAC 的活性進行微調，只要稍微修飾結構就有機會達成目的，這個特點讓 PROTAC 在淘汰率極高的藥物研發上有很大的優勢。
截頭、去尾，用不同的 PROTAC 組合變出新花樣
除了 E3 ligase 要能夠與標的蛋白結合外，標的蛋白上還要有能被 E3 ligase 泛素化的胺基酸序列。因此如果一個召募某 E3 ligase 的 PROTAC ，其泛素化受質的效率過低，那不妨換一個 E3 ligase 試試！如 PROTAC dBET23 其實是把 MZ1 中可以與 CRL2VHL 接合的基團換成沙利竇邁，於是這個 PROTAC 接合的 E3 ligase 就會變成 CRL4CRBN 。另外如果想要使能有效結合 E3 ligase 的 PROTAC 改變標的蛋白，我們就換一個負責與標的蛋白互動的分子：像是把 MZ1 的一端換成可以與凋亡抑制因子 BCL-XL 結合的分子，形成 PROTAC 6 ，CRL2VHL 就可以透過 PROTAC 6 的牽引泛素化 BCL-XL 。因此除了剛剛講過的進行結構的微調，一旦找到好用的 PROTAC ，我們可以透過換個頭或換個尾巴，改變 PROTAC 作用的 E3 ligase 以增進對標的蛋白的降解，或者保留高效率的 E3 ligase 結合能力來泛素化新的標的蛋白。因為其可變性高且作用機制清楚，自 20 年前科學界提出這個可能性之後，到 2021 年年底已經有十多個 PROTACs 進入第一階段或第二階段的臨床試驗，並且這個概念也應用在基礎研究上，於蛋白質層次 Knock down 特定基因。
PROTAC 的現在與未來
我們在之前有說過，生物體中有許多的 E3 ligase ，但是我們可以用 PROTAC 操縱的 E3 ligase 目前也只有研究的較透徹的 VHL、Cereblon 等，未來或許能夠開發使用不同 E3 ligase 進行標的蛋白降解的 PROTAC ；另外 PROTAC 已經愈發頻繁地被應用於基礎研究中，是一種進行 Conditional knockdown 的新選擇。 PROTAC 做為藥物的研發似乎還有一段路要走，因為我們目前對於 PROTAC 在人體內的效應所知尚不多，像是能不能在人體穩定存在、反應效率是否能夠改善症狀並治癒病灶等等……都是 PROTAC 在臨床試驗將面臨的問題。不過隨著越來越多的 PROTAC 進入臨床試驗階段，在未來我們將更有機會見證這項精妙的蛋白質降解技術對人類福祉的貢獻。
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