第三種可能：在斑馬魚身上探索未知——無合成分裂

撰文：生科二 邱柏偉
校稿：生科二 郭映妤

在不久之前，大家普遍認為生物界中只有兩種細胞分裂的模式：為產生大量體細胞的有絲分（mitosis）及為產生有性生殖配子的減數分裂（meiosis）。長久以來科學家一直將這視為生物界的鐵則，但中研院陳振輝老師團隊在斑馬魚再生研究過程中，意外發現一種性質與上述兩者不盡相同的「無合成分裂（asynthetic fission）」[1]，可以說是第三種細胞分裂的方式。究竟無合成分裂是什麼？而陳老師又是怎麼發現這樣前所未見的現象呢？就讓我們帶你來看看！

發展palmskin技術用於斑馬魚表皮細胞觀察

斑馬魚（Danio rerio）是生物學家常用於研究發育生物學的模式生物。近年來也開始有人利用斑馬魚研究生物體的再生機制 [2]，投身於再生研究領域的陳振輝老師也在此行列之中。

之前的研究指出斑馬魚的皮膚分為多層，其中最表層的表皮細胞 superficial epithelial cells （SECs）皆分化完成（terminally-differentiated），若要產生新的 SECs，通常認為由最下層的幹細胞分裂分化產生。已知斑馬魚幼魚在受精後的 8-14 天（days post-fertilization; d.p.f.）體型會快速增長，需要表皮細胞的高速增生，而陳老師好奇的就是在這種情況下表皮下層幹細胞的分裂模式。

為了能更視覺化的解構斑馬魚表皮細胞分裂的樣態，研究團隊以 Brainbow 技術為基礎 [3]，發展出一種稱為 palmskin 的多色細胞標記技術。其中，帶有不同顏色螢光蛋白基因（包含紅綠藍三色）的 DNA 片段會先被轉殖入斑馬魚的細胞中，接著在指定的發育時期（4 d.p.f.）用專一的活化表皮組織內 Cre 重組酶（Cre recombinase），使上述 DNA 片段中不同對 lox 序列之間夾取的片段被隨機且不可逆的切除，造成不同細胞所表現的螢光基因不同、表現量也不同，在螢光顯微鏡下因為紅綠藍顏色成分比例相異，每個細胞因而產生不同的顏色。待表現螢光蛋白的幹細胞再行分裂時，同一細胞分裂產生的子細胞則會跟原本的母細胞呈現相同的顏色，如此一來，便可應用譜系追蹤（lineage tracing），追蹤母細胞跟子細胞的關係與分布。

Fig 1. 陳振輝老師團隊設計的 Cre/lox 序列示意圖。以 ubi 作為 promoter（ubi是一個在各個階段的斑馬魚身上都能表現的 promoter，常用於轉殖基因啟動 [4]），三角形為 lox gene 所在處。Cre 重組酶隨機切除 lox 序列夾住（flanked）的基因段，導致最後紅綠藍表現量各不同而有彩色現象 [1]。

實際操作實驗後陳老師和論文的第一作者陳潔盈發現在大約8 d.p.f.時顯微鏡下可以找到兩個或四個相同顏色的細胞聚集在一起，顯示所標示的細胞有分裂的現象，代表 palmskin 技術成功的標定到具有分裂能力的下層幹細胞；但後續的實驗卻出現了意想不到的轉折，隨著斑馬魚的成長，這些被標定的細胞居然消失在顯微鏡的視野下！面對這種情況，一開始陳老師的團隊認為可能是這個 Cre/lox 系統的基因無法維持穩定表現，隨著斑馬魚的發育，螢光訊號就消失導致細胞無法被偵測到。如果是如此，對於原先想觀察幹細胞分裂與後續發展的目的而言，此工具便不適合，瓶頸突現。

掙扎與驗證了好一陣子，陳老師憑藉著他對斑馬魚皮膚構造的了解，他開始懷疑顯微鏡下訊號的消失還有另外的解釋，會不會從一開始 palmskin 技術標定到的就不是表皮下層的幹細胞，而是上層會隨後續發育脫落而導致觀察不到的 SECs 呢？

「正常人都是對著靶射箭，但為什麼我們不能先射箭再畫靶呢？」

　　面對這些不同的可能性，陳振輝老師表示他認為科學有一定的彈性，科學家只要保持敏銳的觀察力和想像力及面對挫折不放棄的精神，研究的路上可以有無限的可能性。秉持著這樣的精神，陳老師脫離了原先的研究路線，轉而嘗試利用不同的研究工具驗證SECs 分裂的可能性，最後結果和老師預測的一樣：palmskin 所標記到的是皮膚最表層的表皮細胞，而不是他們原先預期的下層幹細胞。

針對這樣前所未見的發現，陳振輝的實驗室利用了一系列的實驗來測試這種特殊細胞分裂的特性。他們發現單一母細胞最多只能分裂兩次產生4個子細胞，且分裂前不需要經過遺傳物質的複製，形成一整群遺傳物質含量少於正常 2N 的細胞（sub-2N population）。陳老師將這樣不需 DNA 複製即可細胞分裂的現象命名為「無合成分裂」。無合成分裂所形成的細胞沒有完整的基因體，只有在發育的過渡階段才會出現，之後便會脫落，這也是為何在斑馬魚成魚身上看不到這些 sub-2N 細胞的存在（詳細情況及證據見附錄中的影片A）。

Fig 2. Palmskin 技術標定出 SECs 後在共軛焦顯微鏡下的樣子。顏色的不同展現出Fig 1.提及的每個細胞之差異 [1]。

展望未來，拋磚引玉

至於為什麼斑馬魚的表皮要進行這種特殊的分裂，由於這種現象只存在於斑馬魚幼魚一段快速生長的時期，且分裂後子細胞的總體積和原來母細胞的體積幾乎相同，只是細胞的總表面積有增加的現象。因此陳老師團隊推測這種機制可能是為了應付快速生長時的需求，以最節省能量和資源的方式讓表皮快速擴張，來讓斑馬魚得以高速成長同時維持多層皮膚的保護。未來，陳老師期待能在除了斑馬魚以外的生物系統觀察到無合成分裂這個現象。無合成分裂的發現，讓很多科學家過去意想不到的研究成為可能，開拓了嶄新的研究領域，留待更多人投入探索。

科普小知識

以動物為模式生物的研究中經常會使用 Cre/lox 系統來調控特定基因的表現。Cre 是 Cre 重組酶 （Cre recombinase）的縮寫，它可以辨識特定的 lox 序列並使 DNA 的序列重排。若一個DNA constrct 中含有兩個反向的 lox 序列，則 Cre 會將這兩段 lox 之間的序列反轉；如果兩段 lox 序列是同向的，則 Cre 會將 lox 之間的序列切除。在此研究中，研究團隊將多條 DNA construct 導入細胞中，並在特定的發育時期激發 Cre 的活性，讓 Cre 隨機切除 construct 上任意一組 lox 所夾的序列。隨機切除的結果就是每個細胞受螢光激發後顯現的顏色都不盡相同，因為仍留在 DNA 中的螢光蛋白各自不同，表現量也不同，進而有各種顏色混和後多彩的效果。化困難為轉機，意外發現無合成分裂。

Reference:

[1]　Chan, K.Y., Yan, CC.S., Roan, HY. et al. Skin cells undergo asynthetic fission to expand body surfaces in zebrafish. Nature 605, 119–125 (2022)

[2]　Gemberling M, Bailey TJ, Hyde DR, Poss KD. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics 29, 611–620 (2013)

[3]　Livet, J., Weissman, T., Kang, H. et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature 450, 56–62 (2007)

[4]　Mosimann C, Kaufman CK et al. Ubiquitous transgene expression and Cre-based recombination driven by the ubiquitin promoter in zebrafish. Development 138, 169–177(2011)

Supplements:

    A. Video of asynthetic fission on zebrafish skin from Nature