作者：敬華
校稿：莊焙祺、劉宇宸、陳奕叡
鎳（Nickel）是現代工業科技中不可或缺的金屬元素，特別在依賴電能與儲能系統的應用中扮演重要角色。其英文名稱「 Nickel 」源自德文「 Kupfernickel 」，意指「銅之惡魔」，因為早期的礦工經常誤將含鎳的綠色礦石誤認為高價的銅礦，卻無法從中提煉出銅，導致其被冠以帶有惡意的小妖精之名。除了讓早期的銅礦採集難度提高外，鎳在生物體中的功能也同樣令人困惑。只有少數的生物能夠利用鎳離子，對於其他生物而言鎳化合物是有毒性的。鎳作為酵素的輔因子，化學原理上因為具有多個可能的氧化態，是個很好的氧化劑以及還原劑，這個性質能幫助酵素獲得轉化空氣中的氣體成為養分和能量來源的能力，在能夠利用鎳的生物中，我們發現這些酵素負責轉化二氧化碳，使其變成簡單的有機碳——醋酸根。另一方面，也有一些細菌使用含鎳酵素進行恰恰相反的反應，釋放造成嚴重溫室效應的甲烷以及二氧化碳。微生物使用含鎳酵素來進行這些反應對他們本身有甚麼好處呢？另外，甚麼樣的蛋白質骨架可以驅使鎳離子發揮強大如工業催化劑的反應性？
產甲烷菌與釋放甲烷的 F430 因子
在無氧環境中，厭氧微生物是清除有機物降解時所產生的氫氣以及二氧化碳的重要角色。其中一支古菌（Archae）——產甲烷菌（Methanogens）利用二氧化碳氧化對生物體有害的氫氣；雖然被還原的二氧化碳能被產甲烷菌當作碳源，但在大多數的情況下，這些產甲烷菌會直接釋放出甲烷，這樣的單碳代謝路徑稱為沃爾夫循環（Wolfe cycle）。雖然透過還原二氧化碳所累積的能量相當低，但這可能是在有氧呼吸出現以前的重要產能方式，而且直到今日他們仍是在不可行呼吸作用的環境中的重要分解者，我們可以在濕地底泥、家畜的腸道、深海基質中發現許多這類古菌。然而甲烷是造成溫室效應的氣體之一，產甲烷菌也是畜牧業排放大量甲烷、加劇全球暖化的原因之一，因此他們的存在對我們而言可能是壞消息。
科學家發現，沃爾夫循環中最後的一個步驟：甲烷的釋放，需要甲基輔酶 M 還原酶（Methyl-CoM Reductase, MCR）以及其輔酶 F430 因子 （cofactor F430）的參與。F430 與血紅素結構相當類似，兩者最重要的差別在 F430 中，四吡咯環（Tetrapyrrole ring）中間結合了鎳離子（Ni（I））而非亞鐵離子（Fe（II））。F430 只在產甲烷菌中存在，且在釋放終產物並重啟循環的過程中不可或缺，其中相當處於低氧化態的鎳離子能夠還原輔酶M上的甲基形成甲烷，作為電子轉移過程的中點（圖一）。
F430 的存在與否決定了產甲烷菌的生死，而其中直接參與甲烷釋放的鎳離子當然也是如此：產甲烷菌除了得在無氧環境生長之外，鎳也是決定產甲烷菌落生長速率的必需元素。因此當地殼的鎳含量增加時，產甲烷菌的數量似乎也會跟著增加，而肉眼不可見的產甲烷菌有可能對我們的環境造成巨變。二疊紀大滅絕是已知最嚴重的生物大滅絕事件，雖然成因仍眾說紛紜，但由碳同位素比例的變化，科學家們能夠得知當時二氧化碳以及甲烷曾急遽增加，而這可能與甲烷菌的大量增生有關。除了當時的氧氣含量下降而更適合產甲烷菌生長以外，地層證據顯示頻繁的火山活動使得地函中的鎳被送到地殼，因此多餘的鎳更使產甲烷菌的繁殖越發快速，更多有機碳被轉化成甲烷釋放到大氣層中。換句話說，鎳作為沃爾夫循環中的重要輔酶，鎳的增加可能透過產甲烷菌的利用而間接導致了當時的氣候變遷。很難想像僅在特定物種中發生的生化反應，竟然能有這麼大的影響力，同時也說明了鎳雖然在生物體中是冷門的輔酶選擇，但它能透過產甲烷菌影響地球的碳循環。
固碳排碳兼行的雙面刃：一氧化碳去氫酶/乙醯輔酶A合成酶複合體
講到把大氣中的二氧化碳轉變成有機碳供生物利用的自營生物（Autotroph），多數人想到的應該是能行光合作用的植物與藻類。然而在缺氧環境中，還有另一群的生物同樣能利用二氧化碳產生有機物醋酸，並將醋酸活化成乙醯輔酶A以合成醣類、脂質。產醋酸細菌（Acetogen）能夠利用一氧化碳去氫酶/乙醯輔酶 A 合成酶（CODH/ACS）這個龐大的酵素複合體，把從二氧化碳還原而來的甲基以及一氧化碳，縮合成乙醯輔酶A上的乙醯基。這個酵素複合體包含三種酵素：將二氧化碳還原成一氧化碳的一氧化碳去氫酶（CO dehydrogenase, CODH）、執行縮合反應的乙醯輔酶 A 合成酶（Acetyl-CoA Synthase, ACS），以及提供甲基的類咕啉-鐵硫蛋白（Corrinoid-FeS protein, CFeSP）。
CODH 與 ACS 都是需要含鎳輔因子才能執行其功能的酵素，更令人驚奇的是鎳輔因子並不是像 F430 單獨存在，而是與其它的金屬透過硫原子的配位，形成罕見的金屬簇（Metallocluster）。在 CODH 催化位的金屬簇 C-Cluster ，是一個二價鎳離子與四個鐵原子、四個硫原子形成正方體狀的輔酶；而 ACS 催化位的金屬簇 A-Cluster 則是含有兩個鎳離子的金屬簇。我們透過光譜學、結構生物學、X 光吸收光譜等研究金屬輔因子的研究方法，確認鎳離子直接參與這兩個酵素催化的反應（圖二）：科學家推測產醋酸菌的 CODH 中，二氧化碳會與鎳、鐵共配位形成碳-鎳金屬鍵，接著形成羰基-鎳（羰基指與金屬配位的一氧化碳）錯合物，然後釋出一氧化碳；而在 ACS 中，作為反應中心的二價鎳離子首先接收來自 CFeSP 的甲基，一氧化碳又與鎳形成羰基鎳錯合物，甲基隨即轉移到羰基，形成配位在鎳離子上的醋酸，最後輔酶A取代鎳離子，結合醋酸根形成乙醯輔酶 A。 CODH/ACS 是伍德-隆達爾途徑（Wood-Ljudahl）的終點，在光合作用生物尚未出現前，自營生物多是利用此途徑從環境中獲得碳源，而且科學家推測所有細胞生物的最晚共祖（LUCA）可能就是利用伍德-隆達爾途徑固碳的生物。 CODH/ACS 的例子凸顯了鎳作為生物輔酶的重要性：雖然使用鎳作為輔因子的酵素屈指可數，但鎳是協助原始生物獲得化學能的重要元素。
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然而除了產醋酸菌，還有另一類的細菌與古菌能夠把醋酸轉化為二氧化碳與甲烷，相當於進行了反向的伍德-隆達爾代謝，其中把醋酸一分為二的酵素與產醋酸菌的 CODH/ACS 胺基酸序列極其相似，甚至用了同樣的金屬簇！不只如此，還有細菌的 CODH/ACS 可以進行醋酸根的合成以及分解，說明了可能還有鎳離子以外的因素決定醋酸的合成或分解。
比較不同活性的 CODH/ACS 結構，科學家們發現一些細菌的 CODH 可以單獨存在，這類的 CODH 進行的通常是一氧化碳的氧化，釋出二氧化碳；而只有具產醋酸能力的 CODH ，會與 ACS 穩定形成複合體。這兩種 CODH 除了酵素的四級結構不同，受質（一氧化碳或者二氧化碳）如何在酵素中穿梭也有明顯的差異（圖三）。氧化一氧化碳的 CODH 具有從 C-cluster 分岔向酵素表面及向 A-cluster 延伸的受質通道，而在產醋酸或兼性 CODH/ACS 複合體中， CODH 的受質通道僅剩與 ACS 相通的部分，位於表面且可能作為二氧化碳釋出的通道，被較大的胺基酸側基擋住了。這個觀察顯示如果一氧化碳和二氧化碳的生成是可逆的，將兩者其一從 C-cluster 裡面移除的效率越好，化學平衡原理就會導致同樣的產物的產率較高（例如釋放二氧化碳的效率高，一氧化碳與二氧化碳的平衡就會傾向製造二氧化碳）。 ACS 的受質通道能夠幫助一氧化碳以正確的角度與鎳離子形成鍵結，而在產醋酸分解的 ACS 中這個結構也同樣存在，差別在於能夠引導一氧化碳離開 A-cluster 的通道，則是由 CODH 所構成，這樣的結構差異如何影響活性差異則有待其他酵素結構的證據來補充。
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圖三：不同功能的 CODH/ACS 結構。
（左圖）D. vulgaris CODH 是主要執行 CO 氧化的酵素，其結構中有數個從反應中心 C-cluster 到酵素表面的空間（深紅色），可用於釋放產物 CO2 或者獲得受質 CO。除了本身結構的特性之外，這類的 CODH 也無法與 ACS 形成複合體。（中圖）產醋酸菌M. thermoacetica 的 CODH/ACS 複合體中，CODH 通往酵素表面的受質/產物通道 (深紅色)就沒有像單功能的 CODH 一樣多，但是他們與 ACS 的反應中心 A-cluster 間也有能讓 CO 從 C-cluster 進到 A-cluster 產生醋酸的通道。（右圖）分解醋酸產生 CO2 與甲烷的產甲烷菌M. thermophila 的 CODH/ACS 複合體與 M. thermoacetica CODH/ACS 相似，但 A-cluster/C-cluster 間的通道(灰色)主要由 CODH 所貢獻。
含鎳酵素的未來研究與潛能
透過介紹這些以鎳離子作為輔酶的酵素，相信讀者發現這些酵素的功能對於人類而言有好也有壞。然而，大部分的含鎳酵素都在厭氧菌中發現，暴露在大氣中即會失去活性。因此如果要利用這些功能強大的酵素，例如想要利用 CODH/ACS 移除二氧化碳並提升生質能源的產量，就必須了解進行逆反應的機制為何，應該如何避免釋放溫室氣體，同時要知道為何它們無法在有氧的環境下執行功能。透過結構生物學的蛋白質結構，微生物學的研究了解輔因子如何裝載到酵素上，動力學研究鎳如何參與反應等等，我們將對這些酵素越來越熟悉，並且知道要如何進行蛋白質結構的改造，以達到我們的目標。
另一方面，有另外一群科學家正在透過蛋白質設計，將本來不會利用鎳離子的酵素，改造成與自然界中的含鎳酵素功能相仿的人工蛋白質。前述 CODH/ACS 的例子暗示蛋白質只是提供能控制反應走向的三維結構，但鎳離子才是反應過程最重要的元素，所以有可能製造出能與鎳結合，並且類似天然含鎳酵素活性的蛋白質。這個策略的好處是學者們可以大量取得酵素，以作為較易操作的模式蛋白質，研究天然含鎳酵素的反應機轉；另一方面人工酵素能夠在有氧氣的環境運作，更符合工業化的需求。舉例而言，人工的 ACS 已經被發表，該研究團隊透對青藍蛋白（Azurin）進行多個點突變，使其原本的銅離子結合位能夠與鎳離子結合，並且在外加甲基碘與一氧化碳的條件下，證實其具有合成醋酸的能力（圖四）。雖然這與利用天然受質進行乙醯輔酶A的合成有一段差距，但這個實驗結果證實了以人工設計的含鎳酵素進行應用概念上是可行的。
綜合上述，雖然只有少數的酵素含有鎳離子，但是鎳作為這些酵素中的輔因子，無論是釋放甲烷的 F430，或是 CODH/ACS 中的金屬簇，都展現了令人意想不到的化學活性。更令人驚奇的是，對生物體而言這麼偏門的微量元素，居然有惡搞生物圈中碳循環的能力與潛在應用價值。不禁讓人好奇是否有更多含鎳酵素，參與了不為人所知但重要的生化、生理、生態層面的現象，期待我們未來能夠看到這個搗蛋鬼變出不同凡響的新花樣。
參考資料
[1] Miyazaki, Y., Oohora, K., & Hayashi, T. Focusing on a nickel hydrocorphinoid in a protein matrix: methane generation by methyl-coenzyme M reductase with F430 cofactor and its models. Chemical Society Reviews, 51(5), 1629–1639. (2022).
[2] D.H. Rothman, G.P. Fournier, K.L. French, E.J. Alm, E.A. Boyle, C. Cao, & R.E. Summons, Methanogenic burst in the end-Permian carbon cycle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (15) 5462-5467, (2014).
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